T4 DNA-Ligase 5u gemäß UL 500U Molecular Cloning Kit

Modell Nr.
G3340-100
Verwendung
Laborreagenzien, Analytische Reagenzien, Teaching Reagenzien
Habit Appellation
Sonder Reagenz
Anwendung
Industrie, Wissenschaftliche Forschung
Immobilien
Biochemischen Reagenzien
Transportpaket
Carton
Spezifikation
500U
Warenzeichen
Servicebio
Herkunft
China
Referenzpreis
$ 20.70 - 31.50
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Produktbeschreibung

Einleitung:
T4 DNA-Ligase kann die Bindung von klebriger oder stumpfender doppelsträngiger DNA oder RNA zwischen dem 5'-P-Ende und dem 3'-OH-Ende mit einer Phosphodiesterbindung katalysieren. Gleichzeitig kann das Enzym auch einsträngige Kerben in doppelsträngigen DNA-, RNA- und DNA/RNA-Hybridketten reparieren.
Aktivitätsdefinition: Eine Einheit Enzym kann 1 nmol 32P-markiertem Pyrophosphat durch Verdrängungsreaktion innerhalb von 20 Minuten bei 37 Grad C in ATP katalysieren (eine Einheit entspricht etwa 200 Hafteinheiten).

T4 DNA-Ligase   -Speicherpuffer: 20 mm Tris-HCl (pH 7,5), 50 mm KCl, 1 mm DTT, 50 % (V/V) Glycerin.
5×T4 DNA-Ligase-Puffer: 250 mm Tris-HCl (pH 7,6), 50 mm MgCl2 , 5 mm ATP, 5 mm DTT, Enhancer.

Lagerung und Transport
Transport mit  nassem Eis; Lagerung bei -20 Grad Celsius, gültig für 12 Monate.
Komponentennummer Komponente G3340-50 G3340-100
G3340-1 T4 DNA-Ligase 250 U (50 μL) 500 U (100 μL)
G3340-2 5×T4 DNA-Ligase-Puffer 1 ml 2×1 ml
Benutzerhandbuch 1
Ligationsreaktion Bedingungen

Die Ligationsreaktion bei 25 Grad für klebrige Enden dauert 5-30 Minuten; die Ligationsreaktion bei 25 Grad für stumpfe Enden nicht mehr als 2 Stunden oder die Reaktion bei 4 Grad Celsius über Nacht.

Umwandlung von Ligationsprodukten

1. Nehmen Sie die kompetenten Zellen (wie E.coli DH5α, E.coli Top10 usw.) aus dem -80ºC-Kühlschrank und legen Sie sie auf Eis, um aufzutauen;

2. Die Probe in den zuständigen Zustand geben, den Boden des Röhrchens vorsichtig mit den Fingern zum Mischen bewegen und 30 Minuten im Eis baden;

3. Dann das Produkt in ein 42ºC Wasserbad zu erhitzen Schock für 90 s. Nach dem Ende des Eises schnell 2-5 min in ein Eisbad legen;

4. Nehmen Sie 900 μL des sterilen SOC oder LB Mediums und fügen Sie es in das EP-Rohr. Nach dem Mischen das EP-Röhrchen auf einen Schüttler legen und 220 Stunden lang bei 37 U/min bei 1 Grad C inkubieren, um die Bakterien wiederzubeleben (es kann auch in einen 37 Grad Inkubator gestellt werden. Ort Kultur für 1 h);

5. Je nach Versuchsbedarf verschiedene Volumen transformierter kompetenter Zellen aufnehmen und in das feste Medium LB mit den entsprechenden Antibiotika geben, die Zellen gleichmäßig verteilen und nach vollständiger Aufnahme der Flüssigkeit die Platte auf den Kopf in den 37 Grad Celsius Inkubator legen und über Nacht kultivieren.


Identifizierung positiver Klone

Die monoklonalen Kolonien auf der Platte angebaut werden für Kolonie PCR-Identifizierung gepflückt, oder nach Kultur, das Plasmid wird durch Restriktion Verdauung oder PCR-Identifizierung extrahiert, oder das extrahierte Plasmid wird direkt sequenziert und analysiert für die Identifizierung.

Vorsichtsmaßnahmen

1. Es wird empfohlen, das Reaktionssystem auf Eis zu konfigurieren.

2. Wenn die Konzentration des Vektors und des Zielfragmentes gering ist, ist es nicht notwendig, Wasser hinzuzufügen und es direkt zu verwenden, um aufzuholen.

3. Es wird empfohlen, dass das molare Verhältnis von Vektor-DNA zu eingefügtem DNA-Fragment 1:3~1:10 beträgt.

4. Eine geringe Niederschlagsmenge im 5×T4 DNA Ligase Buffer ist normal. Es kann vor dem Experiment bei 37 Grad aufgelöst werden und wird nach gründlichstem Mischen verwendet. Es hat keine Auswirkung auf das Experiment; es wird empfohlen, sich in Aliquots aufzulösen und für die Verwendung einzufrieren.

5. T4 DNA Ligase wird empfohlen, bei der Verwendung entnommen und sofort nach der Anwendung wieder auf -20ºC gebracht zu werden.

6. Wenn Elektroporation für Umwandlung verwendet wird, muss das Ligationsprodukt durch Säulenmethode oder Ethanol-Fällungsmethode gereinigt werden.

7. Wenn der stumpfendende Vektor mit dem DNA-Fragment verbunden wird, muss der Vektor dephosphoryliert werden (G3400 wird empfohlen), um seine Selbstzirkulation zu verhindern.

8. Bitte tragen Sie Laborkittel und Einweghandschuhe während des Betriebs.
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